Facebook 
Masuk dengan Email
Teknik Pewarnaan Gram
Teknik pewarnaan Gram dimulai dari pengambilan spesimen, kemudian dilanjutkan dengan persiapan apusan, pewarnaan Gram, dan pemeriksaan slide di bawah mikroskop. Bakteri Gram positif memiliki lapisan peptidoglikan yang tebal, yaitu 20–80 nm, sehingga akan mengambil kompleks stain–mordant primer dan akan tampak biru atau ungu di bawah mikroskop.
Sementara itu, bakteri Gram negatif memiliki lapisan peptidoglikan yang tipis (1–3 nm), kandungan lipid yang lebih banyak, dan persentase cross–linked yang rendah, diikuti dengan lapisan membran luar yang tipis (7–8 nm). Maka dari itu, bakteri Gram negatif tidak mengikat kompleks stain–mordant dan akan tampak merah di bawah mikroskop.[1]
Persiapan Pasien
Persiapan pasien bergantung pada jenis sampel yang diambil. Beberapa jenis sampel yang dapat diambil antara lain sampel darah, biopsi jaringan, cairan serebrospinal, cairan sinovial, bronchoalveolar lavage, sputum, nanah, duh tubuh, dan urin.[2,8,9]
Peralatan
Peralatan yang perlu dipersiapkan dalam melakukan pewarnaan Gram antara lain:
- Mikroskop cahaya
- Kaca objek
- Pipet
- Api bunsen
- Kertas saring
- Inoculation loop
- Minyak imersi[1]
Bahan-bahan yang diperlukan dalam melakukan pewarnaan Gram antara lain:
- Sampel yang akan diperiksa
- Cairan pewarna
Mordant larutan iodin Gram, yaitu iodin 1 g, potassium iodida 2 g, air steril 300 ml
- Zat dekolorisasi (peluntur), yaitu etanol 95% 50 ml atau aseton 50 ml
Counterstain[1]
Cairan pewarna yang digunakan untuk pewarnaan gram terdiri dari larutan A (kristal violet 2 g, etanol 95% 20 ml) dan larutan B (ammonium oksalat 0,8 g, air steril 80 mL).
Cairan counterstain dalam metode pewarnaan ini untuk memberikan warna merah muda pada bakteri gram negatif yang sudah di dekolorisasi. Counterstain terdiri dari stock solution (safranin O 2,5 g, etanol 95% 100 ml) maupun working solution (stock solution 10 ml, air steril 90 mL).[1,12]
Prosedural
Prosedur pewarnaan Gram terdiri dari persiapan apusan, pewarnaan Gram, dan pemeriksaan di bawah mikroskop.
Persiapan Apusan
Cara mempersiapkan apusan yang akan diwarnai adalah:
- Sterilkan inoculating loop pada api bunsen hingga memerah, kemudian tunggu dingin selama sekitar 30 detik. Jika loop masih panas saat spesimen diambil, sel bakteri bisa rusak
- Dengan menggunakan kaca objek (slide) bersih, letakkan spesimen di tengah kaca objek. Jika spesimen diambil dari agar plate, beri 1 tetes air untuk membuat suspensi terlebih dulu
- Dengan menggunakan inoculating loop, apuskan spesimen di atas kaca objek sampai didapatkan lapisan yang tipis, kemudian keringkan di udara
- Panaskan kaca objek dengan melewatkannya di atas api bunsen sebanyak 2–3 kali agar terfiksasi[1]
Pewarnaan Gram
Pewarnaan Gram dilakukan dengan cara:
- Tuangkan cairan pewarna kristal violet pada preparat secara merata, tunggu selama 1 menit
- Miringkan preparat dan bilas dengan sedikit air mengalir
- Tuangkan cairan mordant pada preparat, tunggu selama 1 menit
- Miringkan kembali preparat dan bilas dengan sedikit air mengalir
- Lakukan dekolorisasi dengan cara meneteskan cairan dekolorisasi sedikit demi sedikit pada preparat hingga tidak ada zat warna yang mengalir keluar dari preparat. Kemudian bilas preparat dengan air mengalir
- Tuangkan counterstain (safranin) pada preparat, tunggu selama 30 detik sampai 1 menit. Kemudian bilas preparat dengan air mengalir, kemudian keringkan preparat
- Lakukan pengamatan preparat menggunakan mikroskop dengan perbesaran 100 kali, 400 kali, hingga 1000 kali[4,10]
Gambar 2. Proses Pewarnaan Gram. Sumber: Shutterstock, 2022.
Kesalahan dalam Prosedur Pewarnaan Gram
Terdapat beberapa kesalahan yang dapat terjadi saat melakukan prosedur pewarnaan gram, antara lain:
- Pemanasan berlebihan saat fiksasi
- Preparat terlalu tebal
- Larutan kristal violet konsentrasi rendah
- Pencucian berlebihan dengan air (sebaiknya tidak lebih dari 5 detik)
- Iodin yang kurang. Semakin rendah konsentrasi iodin yang digunakan, semakin mudah dekolorisasi terjadi
- Dekolorisasi yang terlalu lama dengan etanol
Counterstaining terlalu banyak dan terlalu lama[2]
Interpretasi
Pada akhir prosedur pewarnaan gram, dilakukan interpretasi dari preparat. Bakteri Gram positif akan berwarna biru atau ungu, contohnya Staphylococcus sp. dan Streptococcus sp. Bakteri Gram negatif akan berwarna merah atau merah muda, contohnya E.coli dan Salmonella typhi. Fungi seperti Candida dan Cryptococcus dapat juga diperoleh pada pemeriksaan Gram.[4]
Gambar 3. Perbedaan Bakteri Gram Negatif dan Positif pada Pewarnaan Gram. Sumber: Shutterstock, 2022.
Beberapa jenis bakteri memiliki sifat Gram variabel, di mana dapat terlihat campuran sel berwarna ungu dan merah muda. Genus bakteri Actinomyces, Arthrobacter, Corynebacterium, Mycobacterium, dan Propionibacterium memiliki dinding sel yang rentan mengalami kerusakan saat pembelahan sel, sehingga dapat memiliki tampilan Gram negatif.[4,10]
Bakteri Bacillus, Butyrivibrio, dan Clostridium dalam perkembangannya dapat mengalami penurunan ketebalan peptidoglikan, sehingga beberapa sel akan terlihat Gram negatif. Gardnella memiliki dinding sel Gram positif yang berbeda, sehingga menyebabkan hasil pewarnaan menjadi Gram negatif atau Gram variabel.[4,10]
Follow up
Setelah prosedur selesai dilakukan, hasil dilaporkan berdasarkan standard operating procedures (SOP) laboratorium setempat. Hasil yang signifikan kemudian dapat dilaporkan pada ahli patologi atau dokter penanggung jawab pasien. Hasil pewarnaan Gram dapat membantu dokter menentukan diagnosis awal dan pemilihan antibiotik, sambil menunggu hasil kultur dan sensitivitas antibiotik.[2]
Direvisi oleh: dr. Felicia Sutarli
